喉癌中p16和PCNA蛋白相关性分析

增生细胞核抗原又称周期素(proliferating cell nuclear antigen/cyclin)，它是一种36  kd的核磷蛋白，为δ-dna聚合酶的辅蛋白，是dna复制及细胞增殖所必需的，其表达水平是 反映细胞增殖活性较客观的指标。我们的研究表明pcna蛋白的表达与喉癌的病理分级相关 ，即病理分级越差者pcna蛋白的表达越多，而与喉癌的临床分期无关。腾晓东在对食管癌的 研究中也发现类似现象[4]。我们认为病理分级差的肿瘤，其细胞形态幼稚，细胞 分裂能力强，因而作为细胞增殖活性指标的pcna含量较分化良好的肿瘤高。从这点来说，pc na对于提示肿瘤的恶性程度及反映肿瘤的预后有一定价值。

p16基因又称mts1、cdkn2基因，位于染色体9p21，由2个内含子和3个外显子组成，编码一个 16 kd的蛋白。p16蛋白能与cdk4结合抑制cyclin d.cdk4复合物的催化活性，从而抑制细胞 增殖[1]。将p16基因转染到膀胱癌细胞中可引起肿瘤细胞生长减慢，致瘤性降低[2]，直接 证明了p16基因的抑癌作用。p.jares等人以喉癌为研究对象，其研究结果表明了p16基因突 变在喉癌中是多发事件[3]。本实验结果表明，p16在喉癌中的表达强度不一，从整体上看病 理分化差者其p16表达少，相反，病理分化好者p16表达多。即p16的表达与喉癌的病理分级 呈负相关，这些结果与p.jares用sscp法检测p16基因突变的结果相似[3]。我们认为喉癌中 由于p16蛋白的缺失，其调节细胞增殖的功能丧失，从而导致细胞的病理性繁殖，在个体水 平表现为肿瘤的形成；而随着p16蛋白缺失的增加，细胞分裂繁殖的速度加快，细胞分化程 度越差。实验结果表明p16的表达与喉癌的临床分期无关，这可能是因为临床分期受到多种 因素的影响，包括延误就诊导致的肿瘤扩散等其他客观因素的影响。
讨 论
p ＜0.01 ＜0.05
ⅱ以上 13 9 3 1 0 30.77 0 2 4 7 100
ⅰ 18 3 4 6 5 83.33 4 6 6 2 77.78
病理分级 例数 - + ++ +++ 阳性率% - + ++ +++ 阳性率%
附表 喉癌中p16和pcna基因的表达情况
18例ⅰ级分化的喉鳞癌中p16阳性者占83.33%，13例ⅱ级分化以上的喉鳞癌中p16阳性者占3 0.77%，两者之间差异非常显著(p＜0.01)。各分期阶段p16的表达差异不显著(p ＞0.05)。ⅰ级分化的喉鳞癌中pcna阳性者占77.78%，ⅱ级分化以上的喉鳞癌中pcna阳性 者占100%，两者之间差异非常显著(p＜0.01)。各分期阶段pcna的表达差异不显著(p ＞0.05)。同时，我们观察到在p16强阳性表达的标本中往往有pcna的低表达，相反，pcn a高表达的标本中存在p16的低表达，但两者缺乏肯定的相关性(附表)。
(2)p16、pcna在喉癌中的表达特点
p16、pcna阳性反应物均位于细胞核，胞浆无棕黄色颗粒。在声带息肉上皮层中均可见到几 乎所有的细胞都呈现p16染色阳性，胞核被染成深棕黄色；在喉癌中p16的染色减弱，仅部分 胞核被染成深棕黄色到棕黄色，阳性细胞的数目介于5%～95%之间。声带息肉中pcna的染色 呈现阴性，仅见于散在的基底细胞中，在喉癌中pcna染色呈现阳性，阳性细胞的数目介于30 %～95%之间。
(1)p16、pcna在喉癌中表达的形态学观察
结 果
参照galand三级划分法：+为阳性细胞数＜25%；++为阳性细胞数26%～75%；+++为阳性细胞 数＞75%。阳性标准为细胞核内出现明显的棕黄色颗粒。按病理分级分为鳞癌ⅰ、ⅱ、ⅲ级3 组；按tnm分期分为t1、t2、t3、t4 4组进行统计分析。各组的p16及pcna蛋白表达差异情况 采用sas(statistical analysis system)软件进行分析。
2.方法 31例标本均采用sp(streptavidin peroxidase)法进行检测。第一抗分别为鼠源性 p16单克隆抗体(santa cruz cat#sc-1661)，稀释度1∶400；鼠源性pcna单克隆抗体(dako  no.m0879)，稀释度1∶100。第二、第三抗采用anti-mouse sp试剂盒(购于福州迈星公司) 。每次实验均设阳性对照、阴性对照和空白对照(pbs代一抗)。
1.材料 收集经病理证实的喉鳞状细胞癌标本31例，年龄44～80岁，平均65岁，男28例， 女3例，其中病理分化ⅰ级者17例，ⅱ级者8例，ⅲ级者6例；临床分期t1期9例，t2期6 例，t3期8例，t4期4例，另4例无tnm分期记录。声带息肉5例，作为实验参照物。
材料与方法
p16是一种新的抑癌基因，发现于1994年，p16的缺失见于多种肿瘤。增殖细胞核抗原(proli ferating cell nuclear antigen,pcna)可反映组织细胞增殖活性，pcna表达水平与肿瘤的 生物学行为有关。我们应用免疫组织化学方法，对喉癌中p16和pcna表达水平进行分析，并 探讨两者之间及其与喉癌临床特点的关系。
【key words】 p16; pcna; laryngeal carcinoma； immunohistochemistry
【abstract】 purpose to inves tigate the expression of p16 and pcna proteins in laryngeal carcinoma and their  inter relationship.methods sections of 31 cases of laryngeal ca rcinoma were analyzed with anti-p16 and anti-pcna adopting sp (streptavidin pe roxadase) method of immunohistochemical technique. results perc entage of p16 expression in poorly differentiated laryngeal carcinoma were lower  than that in well differentiated. percentage of pcna expression in poorly diffe rentiated laryngeal carcinoma was higher than that in well differentiated. no de finite relationship was found between p16 and pcna proteins. conclusion  both p16 and pcna play important roles in laryngeal carcinogenesis. ex pressions of p16 and pcna can indicate proliferation and differentiation of lary ngeal carcinoma.
analysis of p16 and pcna protein in laryngeal carcinoma li jipin g, wei sibing, zhou liang. department of otorhinolaryngoloy and head-neck surge ry, renji hospital, shanghai second medical university, shanghai 20001,china
【关键词】 p16； 增殖细胞核抗原； 喉癌； 免疫组织化学

【摘要】 目的 研究喉癌中p16、pcna蛋白的表达情况与临床特点的关系，分析p16和pcna 蛋白表达的相关性。方法 以抗p16、抗pcna(增殖细胞核抗原)抗体为标记物，采用sp(stre ptavidin peroxidase)免疫组织化学方法对31例喉鳞癌石蜡标本进行分析。结果 p16在ⅰ 级喉癌中的表达高于ⅱ级以上喉癌；pcna在ⅰ级喉癌中的表达低于ⅱ级以上喉癌。p16与pcn a的表达缺乏相关性。结论 p16及pcna蛋白与在喉癌的发生、发展有一定关系，其表达情况 可反映喉癌细胞的增殖、分化情况。