血友病的基因治疗

　　3.2病毒介导基因转移法

　　3.2.1反转录病毒载体(RV)：反转录病毒最大优点是能将外源性基因稳定地整合到宿主细胞基因组中，使基因获碍长期稳定表达，是血友病基因治疗的常用载体之一。在反转录病毒改造方案方面，莫洛尼小鼠白血病病毒含内含子的MFG载体系统的应用增加了可感染细胞的种类、病毒滴度和FⅧ、FⅨ表达水平。加入5一内含子的反转录病毒载体GC-samF8EN可感染多种细胞，Dwarki等l_4]用其感染人原代皮肤成纤维细胞，与胶原基质、聚四氟乙烯纤维混合后共同植入严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficentdisease，SCID)小鼠，其后在小鼠血浆中测得较高水平的FⅧ、FⅨ。但反转录病毒的基因转移系统存在如病毒滴度较低、可感染的宿主范围较小易被血清补体灭活、不能感染静止细胞等缺点，限制了反转录病毒在基因治疗领域的进一步应用。近年人们发现以口腔炎疱疹病毒一G[](VSV-G)的蛋白可以代替传统的双嗜性病毒的囊膜来包装反转录病毒，由此产生编号为VSV-G的假型病毒载体具有诸多优点l_7]：(1)病毒滴度高，经浓缩可达10。efu/ml;(2)宿主范围广转染效率高;(3)能抵抗血清抗体灭活作用，为反转录病毒在基因治疗领域注入新的活力。反转录病毒载体的缺点在于只感染分裂期细胞，并且有致突变的危险。

　　3.2.2腺病毒载体(AV)：腺病毒载体感染宿主细胞广泛，感染效率高，可以有效地转染肝脏，是血友病基因治疗中应用较广泛的病毒载体之一。Kay首次证实了应用AV，血友病狗能高水平表达FⅧ和FⅨ。将纯化的单一mini-AdFⅧ经静脉注入血友病A小鼠体内，获得了长期表达的胜利水平(100～800ng/m1)的FⅧl_8]。应用高能腺病毒载体(HCAd)在SCID小鼠模型体内产生了超生理水平的FⅧ和FⅨl_9]，且副作用小。腺病毒载体的缺点是机体对其病毒蛋白易产生免疫反应。

　　3.2.3腺相关病毒载体(AAV)：AAV是感染缺陷性的单链NA小病毒，不与任何已知的人类疾病相关，具有可整合于靶细胞基因组、无载体免疫原性和无致病危险的特点。实验表明，AAV能指导转基因在肌肉、肝脏和中枢神经系统的表达。Chao等。]将包含有疱疹PK启动子的AAWBDDFⅧcDNA注入SCID小鼠体内后，FⅧ水平达6~10ng/ml;注射2周后出现hFⅧ抗体，但在lO个月后抗体消失，FⅧ表达量达58ng/ml，表达时间达l8月之久。Nakai门静脉注射EFla启动子的重组AAV也得到高水平的FIX表达。最近陆华中等采取定点诱变技术获得了高活性的人FⅨ突变衍生物基因，并利用一个新的AAV制备系统，FIX获得了较高水平的表达和一定时间内的治疗效果。AAV载体的缺点是纯化困难，包装容量小，有致癌的危险。

　　4靶细胞

　　这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是：(1)必须较坚固，能耐受处理易于由人体分离和回输;(2)具有增殖优势，生命周期长;(3)易于受外源遗传物质的转化;(4)选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等